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精子发生是一个持续而动态的发育过程，在这个过程中，一个单一的二倍体精原干细胞不断增殖和分化，最终形成成熟的精子。
在这里，我们总结了关于SSC及其在辐鳍鱼类睾丸中的分布的积累知识。我们还回顾了对鱼类精原细胞自我更新与分化的主要内分泌和旁分泌影响。
为了提供关于SSC相关技术和研究的见解，我们回顾了基于它们独特的生理化学和生化性质来富集未分化精原细胞的现有协议和进展。
我们总结了在体外培养条件下培养生殖细胞的情况，这些条件旨在维持选定鱼类的精原细胞的增殖和存活。
在传统的培养系统中，血清和饲养细胞被认为是SSC自我更新的必需条件，与最近开发明确定义的培养基和生长因子诱导长期培养中的SSC自我更新或分化的系统形成对比。
在稀有、濒危或商业养殖的鱼类品种中建立生殖细胞培养有助于进行生物技术操作，如冷冻保存和移植，从而实现高效的SSC传播。
精子发生依赖于SSC的活动，这些细胞能够进行自我更新，产生更多的干细胞，或分化为专门用于精子发育的子细胞。
SSC自我更新和分化之间的平衡是维持精子发生的稳态的基础。如果其中一个过程占据主导地位，就会导致睾丸癌或精子发生的耗竭。
在表现为连续精子发生的脊椎动物中，这两个过程同时发生，而在季节性繁殖物种中，随着性腺开始成熟，从自我更新到分化的切换被观察到。
精原干细胞在睾丸中的一个专门的微环境中保持着，称为睾丸小环境。
这个小环境提供了在睾丸中调节SSC活动的生长因子和细胞间相互作用：细胞周期的静止、保持未分化状态、通过自我更新的增殖以及凋亡。
该小环境可以被定义为通过防止其分化来维持干细胞的未分化状态的微环境，通常由以下组成：支持细胞；干细胞；以及周围的细胞外基质。
在哺乳动物中，精原干细胞位于精小管上皮的基底膜上，并与支持细胞Sertoli细胞接触，通过物理和旁分泌相互作用来控制精原干细胞的命运。
除Sertoli细胞外，精小管周围的肌外膜细胞和Leydig细胞可能也会向小环境中提供可溶性生长因子。
哺乳动物的精原干细胞首选位于精小管的那些靠近间质组织的区域，那里有Leydig细胞和血管。最近的研究表明，小鼠精子不分化型A均匀分布在精小管上皮的基底膜上。
已经证明，在富含纤维芽细胞生长因子的区域，即与血管临近和间质临近的区域，精原干细胞的自我更新和增殖得到了加强。
而精原干细胞必须暴露在足够高水平的FGF下，以维持其自我更新状态。在非羊膜动物物种中，精原干细胞及其小环境研究较少。
在鱼类和其他非羊膜动物中，精原干细胞是单个细胞，不直接位于基底膜上，而是完全被Sertoli细胞胞质突起包围。
与哺乳动物类似，鱼类也有被认为是不分化精原细胞的精原干细胞。有证据表明，多种鱼类物种，包括古老的物种如鲟鱼中存在两种单一的不分化精原细胞亚型。
在人类中，两种单一的A精原细胞显示相似的特征：一种“淡”型起储备作用，另一种“深色”，活跃型。
在印度鮰鱼Oryziaslatipes中，Nakamura及其合作者在使用BrdU脉冲追踪实验时，也揭示了不同的快速和缓慢分裂的卵母细胞干细胞种群。
就精原细胞是否在鱼睾丸内显示出优先分布而言，斑马鱼和Astyanaxaltiparane的研究表明，Aund*和Aund精原细胞都位于靠近间质区，与产生雄激素的Leydig细胞和血管接触。
这些观察结果表明，在鱼睾丸的生态位中，雄激素、生长因子和血管供应的氧气、营养和激素可能在SSC的维持和自我更新与分化方面起着关键作用。
已经证明Aund型精原细胞还表现出性塑性，能够在移植到斑马鱼卵巢时脱分化并分化为卵母细胞。
移植到性别未分化的幼虫中的Aund型精原细胞能够分化为功能性精子或卵子，取决于受体的遗传性别。
综合这些发现，这些结果提供了证据表明SSCs代表了Aund型精原细胞的一个子集。尽管近几十年来关于鱼类SSCs的信息有所扩展。
但只有少数物种中已经确定了SSC的标志物，这限制了检测和分离SSC的能力。与哺乳动物情况类似，在过去的十年中，精原细胞移植是评估鱼类假定的SSC的“干性”的唯一方法。
有证据表明，早幼粒白血病锌指蛋白，哺乳动物SSC维持所必需的转录抑制因子，可以作为鱼类SSC的标志物。
在新热带鲶鱼Rhamdiaquelen中，原位杂交显示，plzf在Aund型精原细胞中强烈表达，但在Adiff型精原细胞中也有检测到，尽管强度较低。
神经胶质细胞源性神经营养因子是参与哺乳动物SSC维持的Sertoli细胞生长因子。GDNF结合受体GDNF家族受体α1与SSC的膜相结合，在几种哺乳动物物种中被认为是SSC的标志物。
已经在尼罗罗非鱼、虹鳟鱼、斑点狗鲨和鲤鱼的Aund型精原细胞中检测到GFRα1。在虹鳟鱼中，gdnf在生殖细胞中从精原细胞到精细胞都有表达，但不在Sertoli细胞中表达。
这表明与哺乳动物不同，它不是虹鳟鱼睾丸中的自分泌SSC微环境因子。转录因子NANOG和Pou5f3在哺乳动物的SSC以及一些鱼类中表达。
在斑马鱼中，nanog仅在精原细胞中表达，在卵巢和睾丸的体细胞中不存在。在鲤鱼中，POU2在Aund型精原细胞中检测到，在精原细胞分化时表达下降。
通过使用这些抗体结合荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选，可以富集Aund精原细胞并提高在选定的硬骨鱼类中的移植成功率。
该方法具有在鱼类中识别SSC分子标记的潜力，并具有分离和富集SSC以进行下游研究，如单细胞RNA测序或体外实验的潜力。
二、鱼类生殖细胞的分离与富集流式细胞术以及FACS已经用于细胞分选已经有四十多年的历史了。流式细胞术是一种快速而定量的技术。
可以使用与细胞大小、形状、颗粒度、表面、细胞内蛋白质和基因表达相关的各种荧光和光散射信号来检查单个细胞。
当异质性细胞群通过激光系统时，通过光散射和荧光所指示的形态、存活性和表面标记等特征被捕获和分析，可以收集具有定义信号的细胞。
对于一些转基因鱼类，可以根据它们的自体荧光特性，通过FACS对目标细胞进行分选。对于一些不能或不适合使用转基因技术的濒临物种和养殖物种。
通常会进行基于细胞表面上存在的分子的数量和类型的高分辨率免疫亲和技术，这些分子可以被与荧光或磁性微珠结合的特异性单克隆抗体所靶向。
在哺乳动物中，已经使用FACS从小鼠睾丸细胞悬液中分选SSC。精原细胞富集了具有α6整合素阳性、c-kit表达、低侧向散射以及αv整合素阴性或低表达等特征的特性。
在罗非鱼中，使用丙碘明和羧荧光琥珀酰亚胺酯差异染色的细胞群经FACS鉴定和定量。然而，关于生殖干细胞表面标记物的研究很少。
Nagasawa及其同事鉴定了淋巴细胞抗原75作为虹鳟和太平洋蓝鳍金枪鱼Thunnusorientalis中原始生殖细胞和有丝分裂生殖细胞的表面标记物。
进一步的研究表明，物理化学特性，如高前向散射和低侧向散射，可用于从GFP转基因虹鳟中分选A型精子母细胞。
精子母细胞在细胞内结构简单的大细胞群中得到显著富集，Ichida等人建立一种根据前向散射特性来纯化太平洋蓝鳍金枪鱼未成熟、成熟和生精睾丸中的A型精子母细胞的方法。
利用FCM，精子母细胞相对于未排序的细胞群富集了15倍。这些发现表明，前向散射特性适用于富集A型精子母细胞，而无需使用转基因和细胞表面抗体等细胞标记系统。
这些抗体能够识别太平洋蓝鳍金枪鱼A型精子母细胞的细胞表面抗原，并在与荧光染料结合后用于识别接种到受体中的活细胞精子母细胞。
这在应用于商业有价值或濒危物种，这些物种缺乏转基因品系或用于识别细胞谱系的特定分子标记物时，具有重要优势。
流式细胞术是一种自动化的、多参数的、复杂的分选工具，需要熟练的技术和昂贵的设备，对于许多实验室来说难以承受。
它可能需要使用荧光抗体对细胞进行标记，这可能会改变细胞及其功能，相比之下，磁珠分选不需要流式细胞仪，可以通过相对简单的方法在短时间内完成。
它使用能够与目标细胞特异性结合的磁性珠子。被分散的睾丸或卵巢细胞悬液与直接或间接与特定表面抗原结合的单克隆抗体共同孵育。
一旦与目标细胞结合，珠子会受到磁力的作用，允许固定结合的细胞类型并与悬液中的其他成分同时分离。
额外的洗涤和洗脱步骤完成了纯化循环，最终得到了特定细胞类型的富集制备。这种技术也可用于负选择，以消除不需要的细胞。
与需要流式细胞仪的方法相比，MACS是一种简单的技术，除磁性珠子和磁性支架外，不需要特殊设备。该技术对大量细胞非常有效，而且比流式细胞仪更快地收集大量细胞。
在哺乳动物的生殖细胞研究中，磁珠激活的细胞分选常被使用，有多种表面标记物被用于差异分选精原细胞。
在仓鼠、小鼠和猴子中，c-Kit蛋白已被用于分离不同类型的精原细胞，GFRα1、α6-整合素、CD9和Thy-1已被用于分离精原干细胞。
大多数这些表面标记物也已被应用于鱼类精原细胞的分选。Panda等人使用来自小鼠的抗体，从鲤鱼睾丸中富集了高纯度的A型精原细胞。
相同的标记物已被用于分选沟猫鱼和蓝背鲨鱼的精原细胞。人们普遍认为细胞表面标记物应该具有较低的物种特异性。
就像在FACS中一样，附着在细胞表面的抗体可能会抑制一些细胞功能，因为细胞表面的蛋白质或糖链可能会被抗体掩盖。
为MACS开发的表面标记物/抗体对所有物种都不起作用。它的分辨率也比FACS低，一些通过FACS鉴定的抗体不能被MACS识别，需要进行更多关于鱼类抗体鉴定的研究。
这篇综述总结了硬骨鱼类生殖细胞生物学的最重要方面，包括精原细胞的特性以及分离和培养的新技术。
结合诸如冷冻保存和移植等方法，生殖干细胞的繁殖可以成为研究、水产养殖和濒危物种保护的有力工具。
生殖干细胞的分离、富集和培养条件，以支持它们的增殖而不分化，将有助于克服冷冻保存和移植中生殖细胞数量有限的局限性。
生殖细胞培养对于研究体外有丝分裂增殖、干细胞分化、减数分裂和体外干细胞调控的机制非常有价值。
这一领域的知识发展迅速，揭示了操纵生殖干细胞的新方法和有希望的途径。
